fa کلونینگ ناحیه ایمونوژنیک توکسین B کلستریدیوم دیفیسیل در لاکتوکوکوس لاکتیس با هدف توسعه واکسن دهانی مبتنی بر لاکتوکوکوس علیه کولیت ناشی از کلستریدیوم دیفیسیل میکروبشناسی Microbiology پژوهشي Research <strong><em><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">مقدمه:</span></span></em></strong> <span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">باکتری کلستریدیوم دیفیسیل عامل ایجاد عفونت بیمارستانی و کولیت غشای کاذب می باشد. توکسین </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">B</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> این باکتری به عنوان یکی از فاکتورهای اصلی بیماری زایی این باکتری شناخته شده است. ناحیه اتصالی پذیرنده(</span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">RBD</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">) این توکسین، ناحیه ایمنی</span></span>&nbsp;<span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">زای توکسین شناخته و به گیرنده واقع در روده متصل می شود. هدف این مطالعه کلون نمودن و بیان ناحیه ایمنی زای توکسین </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">B</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> در باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس به منظور تهیه واکسن دهانی مطمئن و ایمن علیه کولیت ناشی از کلستریدیوم دیفیسیل، به عنوان یک روش درمانی جایگزین در مطالعات آینده و مبتنی بر لاکتوکوکوس می باشد.</span></span><br> <strong><em><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">مواد و روش ها:</span></span></em></strong> <span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">ابتدا با استخراج </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">DNA</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> از باکتری کلستریدیوم دیفیسیل و با پرایمرهای طراحی شده، قطعه </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">RBD</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> به روش </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> تکثیر شد. قطعه تکثیر شده در پلاسمید </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pTZ57R/T</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> الحاق و در باکتری </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">E.coli</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> ترانسفورم شد. سپس قطعه </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">RBD</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> با برش آنزیمی توسط آنزیم</span></span>&nbsp;<span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">های </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">NcoI</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> و </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">SacI</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">، از پلاسمید </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pTZ57R/T</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> خارج و خالص سازی شد. قطعه </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">RBD</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> در پلاسمید بیانی </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">&nbsp;pNZ8149</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">برش خورده با آنزیم</span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">‌</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> های مشابه تحت شرایط مناسب</span></span> <span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">الحاق شد. سپس پلاسمید بیانی </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">pNZ8149</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;"> حاوی قطعه با روش الکتروپوریشن درون سلول های مستعد لاکتوکوکوس لاکتیس ترانسفورم شد.</span></span><br> <strong><em><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">یافته های پژوهش:</span></span></em></strong> <span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">پس از غربالگری کلونی های ترانسفورم شده، صحت کلونینگ با&nbsp; انجام </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span></span><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">، هضم آنزیمی بر روی پلاسمید نوترکیب استخراج شده و نهایتاً با تعیین توالی، تایید شد. </span></span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></span><br> <strong><em><span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">بحث و&nbsp; نتیجه گیری:</span></span></em></strong> <span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">لاکتوکوکوس لاکتیس تولید کننده این ناحیه ایمنی زا می تواند به منظور تهیه واکسن دهانی مطمئن و ایمن، به عنوان یک روش درمانی جایگزین جهت کاهش شیوع عفونت کلستریدیوم دیفیسیل</span></span> <span style="font-family:b mitra;"><span style="font-size:10.0pt;">در مطالعات آینده مورد استفاده قرار گیرد.</span></span><br> &nbsp; <em>Introduction:</em> Clostridium difficile bacterium is the leading cause of clinical infection and pseudomembranous colitis. Toxin B (TcdB) of C. difficile is regarded as one of the main virulence factors of this bacterium. Moreover, the receptor binding domain (RBD) of this toxin which is known as an immunogenic domain attaches to its receptor in intestine. This study aimed to clone and express the immunogenic domain of the Toxin B in Lactococcus lactis to provide a safe oral vaccine against colitis caused by C. difficile as an alternative treatment in future studies based on Lactococcus.<br> &nbsp;<br> <em>Materials & Methods:</em> In order to clone this segment, at first, the DNA was extracted from C. difficile, and then, the RBD gene segment was amplified by the PCR method using designed primers. The amplified segment was attached to pTZ25R/T plasmid and transformed into Escherichia coli.&nbsp;Subsequently, the RBD segment was extracted from pNZ9418 plasmid using restriction enzymes, such as SacI and NcoI, and then it was purified in this study. Following that, the RBD segment was cut in pNZ8149 plasmid using the same enzymes and was attached under the proper condition. The pNZ8149 plasmid with segment was transformed into L. lactic competent cells by electroporation method.<br> &nbsp;<br> <em>Findings:</em> After the screening of electro-transformed colonies, the accuracy of cloning was verified using PCR, enzyme digestion on the extracted recombinant plasmid, and sequencing.<br> &nbsp;<br> <em>Discussion & Conclusions:</em> According to the results, L. lactic which produces the immunogenic domain can be used as a safe oral vaccine and can be considered as an alternative therapy to reduce the incidence of Clostridium difficile infection in further investigations.<br> &nbsp; کلستریدیوم دیفیسیل , کلونینگ, توکسین B,, لاکتوکوکوس لاکتیس Clostridium difficile, cloning, toxin B, Lactococcus.lactic 25 34 http://sjimu.medilam.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-5083-1&slc_lang=fa&sid=1 Yasser Rahimi یاسر رحیمی yasserrahimi64@gmail.com 9600319475328460040272 9600319475328460040272 No Dept of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, Iran گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران Mohammad Rabbani-Khorasgani محمد ربانی خوراسگانی m.rabbani@biol.ui.ac.ir 9600319475328460040273 9600319475328460040273 Yes Dept of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, Iran گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران Sayyed Hamid Zarkesh-Esfahani سید حمید زرکش اضفهانی s.h.zarkesh@sheffield.ac.uk 9600319475328460040274 9600319475328460040274 No Dept of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, Iran گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران Rahman Emamzadeh رحمان امام زاده sci_rahman@yahoo.com 9600319475328460040275 9600319475328460040275 No Dept of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, Iran گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران Hossein Keyvani Amineh حسین کیوانی امینه Keyvanlab@yahoo.com 9600319475328460040276 9600319475328460040276 No Dept of Virology, Faculty of Medicine, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran گروه ویروس شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران Marzieh Rezaei مرضیه رضایی m.rezaeibio@gmail.com 9600319475328460040277 9600319475328460040277 No Dept of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, Iran گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران