fa کلونینگ ژن GRA5 توکسوپلاسما گوند‌ای سویه RH در پلاسمید یوکاریوت عمومى General پژوهشي Research مقدمه: توکسوپلاسموز یکی از بیماری‌ های زئونوز و دارای انتشار وسیع در جهان بوده که اثرات شدید بـالینی و دام پزشکی عدیده ای را ایجاد می‌کند. این انگل داخل سلولی باعث عوارض عصبی و بیماری ‌های چشمی در افراد دارای ضعف ایمنی و نوزادان متولد از مادران آلوده می شود. بروز موارد زیاد بیماری همراه با عوارض شدید و کشنده توکسوپلاسموز ضرورت یافتن واکسن مؤثری برای این بیماری را نشان می دهد. یکی از مهم ‌ترین راه‌ های کنترل بیماری واکسیناسیون است که تاکنون واکسنی مؤثر علیه این انگل پیدا نشده است. با عنایت به زئونوز بودن بیماری در جهان، یکی از مهم‌ ترین راه‌ های آلودگی انسان‌ مصرف گوشت‌ های خام یا نیم پز حاوی انگل است. بر همین اساس، استفاده از واکسن مناسب حیوانی نیز می‌تواند باعث تحریک ایمنی حیوان شده و از آن در مقابل تولید کیست در بدن محافظت نماید. با توجه به شیوع وسیع این انگل داخل سلولی در انسان و حیوانات و اثرات شدید و کشنده آن، تولید واکسن‌ های جدید بر علیه این بیماری ضرورت می‌یابد. ایمن سازی با پلاسمید حاوی ژن های کدکننده پروتئین های محافظت کننده، به عنوان روشی نسبتاً ابداعی و راهکاری امید بخش از تکنیک‌های ساخت واکسن به شمار می‌آید. به همین دلیل پلاسمید کدکننده ژن 5GRA را تهیه تا بتوان از آن برای ساخت واکسن بر علیه این عفونت استفاده نمود. مواد و روش ها: در این تحقیق، ژن GRA5 با استفاده از روش PCR در پلاسمید انتقالی pTZ57R کلون و پس از آن در باکتری اشرشیاکلی سوش TOP10 ترانسفورم شد. سپس پلاسمید نوترکیب از باکتری میزبان استخراج و ژن هدف با استفاده از آنزیم‌ های Hind3 و EcoRI از پلاسمید pTZ57Rجدا گردید. در مرحله بعد پلاسمید pcDNA3 برای پذیرش قطعه GRA5 و انجام کلونینگ نیز با آنزیم ‌های Hind3 و EcoRI برش داده شد و ژن GRA5 درون پلاسمید pcDNA3 ساب ‌کلون شد. محصول واکنش اتصال در باکتری‌ فوق ترانسفورم و در محیط LB حاوی آمپی‌سیلین کشت داده شد. پلاسمیدهای نوترکیب pcGRA5 با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، از باکتری تخلیص و در مرحله بعد در سلول یوکاریوتی CHO ترانس فکت گردید و در خاتمه بیان پلاسمید نوترکیب مورد بررسی قرار گرفت. یافته های پژوهش: به منظور تایید مراحل مختلف کار از روش ‌های PCR و برش آنزیمی استفاده شد. پس از الکتروفورز مشخص شد که قطعه GRA5 در پلاسمید pcDNA3 کلون ‌شده است. قطعه مورد نظر بر روی ژل الکتروفورز در حدود 363 bp بود که هم‌اندازه ژن GRA5 توکسوپلاسما گوند‌ای است. به منظور تأیید نهایی، قطعه مورد نظر از تعیین توالی استفاده و با قطعه استاندارد ثبت شده در بانک ژن مقایسه گردید. برای تایید بیان ژن مورد نظر در سلول CHO از روش وسترن بلات استفاده شد. بحث و نتیجه‌گیری: نتایج نشان داد که کلونینگ و ترانسفورم قطعه GRA5 در پلاسمید pcDNA3 با موفقیت انجام شده و با استفاده از روش وسترن بلات بیان پروتئین 13 کیلو دالتونی تایید گردید. Abstract Introduction: Toxoplasmosis is a one of the most world-wide spread zoonosis representing a very serious clinical and veterinary problem. Toxoplasma gondii is an intracellular parasite that causes severe neurologic and ocular disease in immune compromised and congenitally infected individuals. The heavy incidence and severe or lethal damages of toxoplasmosis clearly indicate the need for the development of a more effective vaccine human vaccines are not available and current anti-toxoplasma treatment is disappointing. Immunization with plasmid DNA, a relatively novel technique, is a promising vaccination technique. To improve the immune response by DNA vaccination various is one of the key for the success of the vaccine in the field. One of the most efficient ways to control this disease is immunization. However, so far, there is no effective vaccine available against this pathogen. An important source of human contamination with T. gondii is the consumption of raw or undercooked meat products. Toxoplasma gondii are widely prevalent in humans and other animals which can cause severe or lethal toxoplasmosis. So, the development of a more effective vaccine is needed urgently .Therefore, we prepare gra5 plasmid to use as a vaccine. Materials & Methods: In this study, GRA5was cloned in pTZ57R afterwards, it was transformed into TOP10 strain of E.coli Bacteria. The recombined plasmid extracted from E.coli bacteria and amplified through PCR technique. Besides, pcDNA3 Plasmid for receiving and cloning of GRA5 segment was digested by Hind3 & EcoRI enzymes. GRA5 was sub-cloned into pcDNA3 and the reaction ligation product was transformed for the above bacteria. The bacteria grew in LB culture with ampicillin. Recombined pcGRA5 plasmids were purified from E.coli by Plasmid extraction kit. Finally, recombinant plasmid using cell culture method was expressed in Cho cell. Findings: The accuracy of the results was confirmed by using restriction enzymes and PCR methods. GRA5 was cloned into expression eukaryotic plasmid pcDNA3. After sequencing pcGRA5 plasmid for cell expression Western blot method was used. Discussion & Conclusion: The results showed that cloning and transformation of fragment GRA5 in pcDNA3 was done properly. توکسوپلاسما گوند‌ای، کلونینگ، GRA5، pcDNA3، بیان سلولی، وسترن بلات Immunization, GRA5, toxoplasma gondaii, cell expressio n, DNA vaccine 1 12 http://sjimu.medilam.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-220-3&slc_lang=fa&sid=1 R Naserifar راضی ناصری فر 960031947532846001726 960031947532846001726 No F Ghaffarifar فاطمه غفاری فر ghafarif@modares.ac.ir 960031947532846001727 960031947532846001727 Yes A Dalimi Asl عبدالحسین دلیمی اصل 960031947532846001728 960031947532846001728 No Z Sharifi زهره شریفی 960031947532846001729 960031947532846001729 No