Journal of Ilam University of Medical Sciences

fa ویرایش ژن MALAT1 در ردۀ سلولی سرطان سینه MDA-MB-361 با روش نوین کریسپر Editing of the MALAT1 Gene in MDA-MB-361 Breast Cancer Cell Line using the Novel CRISPR Method بیوتکنولوژی biotechnolohgy پژوهشي Research مقدمه: RNAهای غیرکدکنندۀ بلند به‌طور فعال نقش مهمی در تنظیم بیان ژن، پردازش RNA، اصلاح هیستون و بازآرایی ژن‌های کروماتین ایفا می‌کنند؛ همچنین این مولکول‌ها می‌توانند در فرایند‌های زیست‌شناختی متنوع ازجمله اندام‌زایی، تمایز سلولی، نمو طبیعی، نقش‌پذیری ژنوم، جبران مقدار و روند تومورزایی دخیل باشند. بیان بالای MALAT1 (نوعی lncRNA) در بسیاری از سرطان‌ها، ازجمله سرطان سینه نشان میدهد که اختلال تنظیم MALAT1 در رشد بسیاری از انواع سرطان‌ها عامل مهمی به‌شمار می‌رود. سرطان سینه شایع‌ترین سرطان در میان زنان در سراسر جهان است و تهاجم و متاستاز این بیماری از علل اصلی مرگ‌ومیر مرتبط با آن است. هدف از مطالعۀ حاضر، حذف ژن MALAT1 در ردۀ سلولی MDA-MB-361 سرطان سینه و ارزیابی عملکرد و تأثیرات آن روی بیان ژن‌های مرتبط با آپوپتوز است. مواد و روش ها: در این مطالعه، دو نوع sgRNA توسط نرم‌افزار CHOPCHOP برای اگزون شمارۀ 1 ژن MALAT1 طراحی شد. این sgRNAها در دو وکتور کریسپری به‌صورت جداگانه کلون گردیدند تا وکتورهای نوترکیب PX459-sgRNA1 و PX459-sgRNA2 به وجود آیند. انتقال همزمان این دو وکتور به ردۀ سلول‌های سرطانی MDA-MB-361 با استفاده از لیپوفکتامین 2000 صورت گرفت. ویرایش ژن MALAT1 در سلول‌های دریافت‌کنندۀ وکتورهای کریسپری بررسی شد. میزان بیان ژن‌های مرتبط با آپوپتوز به روش real time PCR آنالیز گردید. میزان تکثیر سلولی و آپوپتوز به‌ترتیب با روش‌های MTT و فلوسیتومتری ارزیابی شد. یافته‌ها: ویرایش ژن MALAT1 به روش کریسپر در سلول‌های MDA-MB-361 صورت گرفت. میزان تکثیر سلولی در سلول‌های گروه تیمار نسبت به گروه‌های کنترل، کاهش معنی‌داری نشان داد (P˂0.05). سطح آپوپتوز در سلول‌های سرطانی که ژن MALAT1 آن‌ها حذف گردیده است، با افزایش چشمگیری همراه بود؛ همچنین بیان ژن‌های آنتی‌آپوپتوزی BCL2 و survivin در سلول‌های تحت تیمار (ویرایش‌شده) نسبت به سلول‌های گروه کنترل، به‌صورت معنا‌داری کاهش یافت (P˂0.05). افزایش بیان ژن‌های پروآپوپتوزی P53، BAK، BAX و FAS نیز در سلول‌های ویرایش‌شده مشاهده گردید (P˂0.05). بحث و نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه تأیید می‌کند که حذف ژن MALAT1 در افزایش آپوپتوز و کاهش تکثیر سلولی تأثیر بسزایی دارد و کاهش بیان ژن MALAT1 می‌تواند از رشد و تکثیر ردۀ سلول سرطان سینه جلوگیری کند؛ بنابراین، به‌نظر می‌رسد کنترل بیان انکوژن MALAT1 برای کنترل تومورها مفید و مؤثر است.   Introduction: Long non-coding RNAs play an important role in regulating gene expression, RNA processing, histone modification, and rearrangement of chromatin genes. These molecules can also be involved in many biological processes, such as organogenesis, cell differentiation, development, genome imprinting, quantitative compensation, and tumorigenesis. High expression of MALAT1 (a type of lncRNA) in many cancers, including breast cancer, indicates that a disorder of MALAT1 regulation is an important factor in the development of many types of cancer. Breast cancer is the most common cancer among women worldwide, and the invasion, as well as metastasis of this disease, are considered among the main causes of death. The present study aimed to knock out the MALAT1 gene in the MDA-MB-361 breast cancer cell line and evaluate its function and effects on the expression of genes associated with apoptosis. Material & Methods: In this study, two types of sgRNA were designed by CHOPCHOP software for exon 1 of the MALAT1 gene. These sgRNAs were cloned separately into two CRISPR vectors to generate the recombinant vectors PX459-sgRNA1 and PX459-sgRNA2. Co-transfection of these two recombinant vectors into the MDA-MB-361 cancer cell line was performed using lipofectamine 2000. MALAT1 gene editing was investigated in the cells receiving recombinant vectors. The expression of genes related to apoptosis was analyzed by Real-Time PCR. Cell proliferation and apoptosis were assessed by MTT and flow cytometry methods, respectively. (Ethic code: IR.IAU.M.REC.1399.010) Findings: The MALAT1 gene was edited by the CRISPR method in MDA-MB-361 cells. The rate of cell proliferation in the cells of the treatment group, compared to the control groups, showed a significant decrease (P<0.05). Apoptosis levels were significantly increased in cancer cells the MALAT1 gene of which had been deleted. Moreover, the expression of BCL2 and survivin anti-apoptotic genes in treated (edited) cells was significantly reduced, compared to control cells (P<0.05). Increased expression of proapoptotic genes P53, BAK, BAX, and FAS was also observed in the edited cells (P<0.05). Discussion & Conclusion: The results of this study confirm that the deletion of the MALAT1 gene has a significant effect on increasing apoptosis and reducing cell proliferation. A reduction in the expression of the MALAT1 gene can prevent the growth and proliferation of breast cancer cell lines. Therefore, it seems that the control of MALAT1 oncogene expression is useful and effective for controlling tumors.   MALAT1, ردۀ سلولی سرطان سینه, کریسپر, آپوپتوز Apoptosis, Breast cancer cell line, CRISPR, MALAT1 18 31 http://sjimu.medilam.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-6760-2&slc_lang=fa&sid=1 Soraya Ahmadi-Baloutaki ثریا احمدی بلوطکی ahmadi1985.ac@gmail.com 9600319475328460045295 9600319475328460045295 No Dept of Genetic, Marvdasht Branch, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran گروه ژنتیک، واحد مرودشت، دانشگاه آزاد اسلامی، مرودشت، ایران Abbas Doosti عباس دوستی abbasdoosti@yahoo.com 9600319475328460045296 9600319475328460045296 Yes Biotechnology Research Center, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران mojtaba Jaafarinia مجتبی جعفری نیا jaafarinia@yahoo.com 9600319475328460045297 9600319475328460045297 No Dept of Biology, Marvdasht Branch, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran گروه زیست‌شناسی، واحد مرودشت، دانشگاه آزاد اسلامی، مرودشت، ایران Hamedreza Goudarzi حامدرضا گودرزی Goudio13456@yahoo.com 9600319475328460045298 0000000278392919 No Dept of Genetic, Faculty of Basic Sciences, Marvdasht Branch, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran گروه ژنتیک، دانشکدۀ علوم پایه، واحد مرودشت، دانشگاه آزاد اسلامی، مرودشت، ایران